凝膠滲透色譜（Gel Permeation Chromatography,GPC）是1964年，由J.C.Moore首先研究成功。不僅可用于小分子物質(zhì)的分離和鑒定，而且可以用來分析化學(xué)性質(zhì)相同分子體積不同的高分子同系物（聚合物在分離柱上按分子流體力學(xué)體積大小被分離開），優(yōu)點是：保留時間短，色譜峰窄，容易檢測等。

凝膠色譜法又叫凝膠色譜技術(shù)，是六十年代初發(fā)展起來的一種快速而又簡單的分離分析技術(shù)，由于設(shè)備簡單、操作方便，不需要有機溶劑，對高分子物質(zhì)有很高的分離效果。凝膠色譜法又稱分子排阻色譜法。

技術(shù)介紹

凝膠色譜法又叫凝膠色譜技術(shù)，是六十年代初發(fā)展起來的一種快速而又簡單的分離分析技術(shù)，由于設(shè)備簡單、操作方便，不需要有機溶劑，對高分子物質(zhì)有很高的分離效果。凝膠色譜法又稱分子排阻色譜法。凝膠色譜法主要用于高聚物的相對分子質(zhì)量分級分析以及相對分子質(zhì)量分布測試。根據(jù)分離的對象是水溶性的化合物還是有機溶劑可溶物，又可分為凝膠過濾色譜（GFC）和凝膠滲透色譜（GPC）。GFC一般用于分離水溶性的大分子，如多糖類化合物。凝膠的代表是葡萄糖系列，洗脫溶劑主要是水。凝膠滲透色譜法主要用于有機溶劑中可溶的高聚物(聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等)相對分子質(zhì)量分布分析及分離，常用的凝膠為交聯(lián)聚苯乙烯凝膠，洗脫溶劑為*等有機溶劑。凝膠色譜不但可以用于分離測定高聚物的相對分子質(zhì)量和相對分子質(zhì)量分布，同時根據(jù)所用凝膠填料不同，可分離油溶性和水溶性物質(zhì)，分離相對分子質(zhì)量的范圍從幾百萬到100以下。近年來，凝膠色譜也廣泛用于分離小分子化合物。化學(xué)結(jié)構(gòu)不同但相對分子質(zhì)量相近的物質(zhì)，不可能通過凝膠色譜法達到wan全的分離純化的目的。凝膠色譜主要用于高聚物的相對分子質(zhì)量分級分析以及相對分子質(zhì)量分布測試。已經(jīng)被生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程學(xué)、分子免疫學(xué)以及醫(yī)學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域廣泛采用，不但應(yīng)用于科學(xué)實驗研究，而且已經(jīng)大規(guī)模地用于工業(yè)生產(chǎn)。

基本原理

分子篩效益

兩種全排阻的分子即使大小不同，也不能有分離效果。直徑比凝膠最小孔直徑小的分子能進入凝膠的全部孔隙。如果兩種分子都能全部進入凝膠孔隙，即使它們的大小有差別，也不會有好的分離效果。因此，一定的分子篩有它一定的使用范圍。綜上所述，在凝膠色譜中會有三種情況，一是分子很小，能進入分子篩全部的內(nèi)孔隙；二是分子很大，wan全不能進入凝膠的任何內(nèi)孔隙；三是分子大小適中，能進入凝膠的內(nèi)孔隙中孔徑大小相應(yīng)的部分。大、中、小三類分子彼此間較易分開，但每種凝膠分離范圍之外的分子，在不改變凝膠種類的情況下是很難分離的。對于分子大小不同，但同屬于凝膠分離范圍內(nèi)各種分子，在凝膠床中的分布情況是不同的：分子較大的只能進入孔徑較大的那一部分凝膠孔隙內(nèi)，而分子較小的可進入較多的凝膠顆粒內(nèi)，這樣分子較大的在凝膠床內(nèi)移動距離較短，分子較小的移動距離較長。于是分子較大的先通過凝膠床而分子較小的后通過凝膠床，這樣就利用分子篩可將分子量不同的物質(zhì)分離。另外，凝膠本身具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大的分子在通過這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上的孔隙時阻力較大，小分子通過時阻力較小。分子量大小不同的多種成份在通過凝膠床時，按照分子量大小“排隊，凝膠表現(xiàn)分子篩效應(yīng)。

重要參數(shù)

⑴柱體積：柱體積是指凝膠裝柱后，從柱的底板到凝膠沉積表面的體積。在色譜柱中充滿凝膠的部分稱為凝膠床，因此柱體積又稱“床"體積，常用Vt表示。

⑵外水體積：色譜柱內(nèi)凝膠顆粒間隙，這部分體積稱外水體積，亦稱間隙體積，常用Vo表示。

⑶內(nèi)水體積：因為凝膠為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，顆粒內(nèi)部仍有空間，液體可進入顆粒內(nèi)部，這就分間隙的總和為內(nèi)水體積，又稱定相體積，常用Vi表示。不包括固體支持物的體積（Vg）。

⑷峰洗脫體積：是指被分離物質(zhì)通過凝膠柱所需洗脫液有體積，常用Ve表示。當(dāng)使用樣品的體積很少時，（與洗脫體積比較可以忽略不計），在洗脫圖中，從加樣到峰頂位置所用洗脫液體積為Ve。當(dāng)樣品體積與洗脫體積比較不能忽略時，洗脫體積計算可以從樣品體積的一半到峰頂位置。當(dāng)樣品很大時，洗脫體積計算可以從應(yīng)用樣品開始到洗脫峰升高的彎曲點（或半高處）。

填料合成

凝膠色譜填料合成技術(shù)的進展主要在下面四個方面：填料的微球化、窄粒度分布多孔硅微球的合成成功、小孔徑多孔硅微球合成成功以及新的硅微球表面化學(xué)改性的發(fā)展。近年來在這方面有較多的新產(chǎn)品，中國也有許多單位在研制和生產(chǎn)。高效凝膠色譜正在迅速改變凝膠色譜的應(yīng)用面。

高效色譜柱除了對填料的粒度有要求外，對粒度分布也要求相當(dāng)窄。用一般的制備方法往往得到粒度較寬的產(chǎn)品，需要進一步過篩。當(dāng)填料的粒度在30微米以下時，這種過篩非常困難，已經(jīng)成為填料制備上一個較大的技術(shù)難關(guān)。Kirkland，最近利用了尿素和甲醛在酸性介質(zhì)中形成大小均勻的液體高聚物，加入某種硅溶膠時，硅溶膠的微珠將在液體高聚物中凝聚。最后把有機高聚物灼燒掉后就能得到由微粒硅珠堆積而成的多孔填料。這種堆積硅珠是球形的，粒度分布很窄，填料的孔徑?jīng)Q定于原始硅溶膠的規(guī)格，用不同的硅膠就可以制得不同孔徑的填料。柴志寬等則利用一種硅膠制成粒度分布窄的填料后，再利用適當(dāng)?shù)臄U孔方法以得到各種孔徑的填料。從這些方法制得的微球填料，粒度分布可以達到相當(dāng)窄，所以可以不經(jīng)篩選直接使用。

隨著進樣技術(shù)和色譜柱接頭設(shè)計的改進，已經(jīng)可以得到柱效每米在八萬到十萬的凝膠色譜填料。Wheals用四種GPC用的微球硅膠裝填色譜柱，都能達到每米八萬到十萬塊塔板數(shù)的高效。他用這種色譜柱有效地進行了案件zhen查中所要求的分析問題。

兩大分類

根據(jù)分離的對象是水溶性的化合物還是有機溶劑可溶物，又可分為凝膠過濾色譜（GFC）和凝膠滲透色譜（GPC）。

凝膠過濾色譜：凝膠過濾色譜一般用于分離水溶性的大分子，如多糖類化合物。凝膠的代表是葡萄糖系列，洗脫溶劑主要是水。

凝膠滲透色譜：凝膠滲透色譜法主要用于有機溶劑中可溶的高聚物(聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等)相對分子質(zhì)量分布分析及分離，常用的凝膠為交聯(lián)聚苯乙烯凝膠，洗脫溶劑為*等有機溶劑。

凝膠色譜不但可以用于分離測定高聚物的相對分子質(zhì)量和相對分子質(zhì)量分布，同時根據(jù)所用凝膠填料不同，可分離油溶性和水溶性物質(zhì)，分離相對分子質(zhì)量的范圍從幾百萬到100以下。

近年來，凝膠色譜也廣泛用于分離小分子化合物?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)不同但相對分子質(zhì)量相近的物質(zhì)，不可能通過凝膠色譜法達到wan全的分離純化的目的。

GPC分離原理

凝膠具有化學(xué)惰性，它不具有吸附、分配和離子交換作用。讓被測量的高聚物溶液通過一根內(nèi)裝不同孔徑的色譜柱，柱中可供分子通行的路徑有粒子間的間隙（較大）和粒子內(nèi)的通孔（較?。?。當(dāng)聚合物溶液流經(jīng)色譜柱（凝膠顆粒）時，較大的分子（體積大于凝膠孔隙）被排除在粒子的小孔之外，只能從粒子間的間隙通過，速率較快；而較小的分子可以進入粒子中的小孔，通過的速率要慢得多；中等體積的分子可以滲入較大的孔隙中，但受到較小孔隙的排阻，介乎上述兩種情況之間。[1]經(jīng)過一定長度的色譜柱，分子根據(jù)相對分子質(zhì)量被分開，相對分子質(zhì)量大的在前面（即淋洗時間短），相對分子質(zhì)量小的在后面（即淋洗時間長）。自試樣進柱到被淋洗出來，所接受到的淋出液總體積稱為該試樣的淋出體積。當(dāng)儀器和實驗條件確定后，溶質(zhì)的淋出體積與其分子量有關(guān)，分子量愈大，其淋出體積愈小。

（1）體積排除

（2）限性擴散

（3）流動分離

校正原理

用已知相對分子質(zhì)量的單分散標準聚合物預(yù)先做一條淋洗體積或淋洗時間和相對分子質(zhì)量對應(yīng)關(guān)系曲線，該線稱為“校正曲線"。聚合物中幾乎找不到單分散的標準樣，一般用窄分布的試樣代替。在相同的測試條件下，做一系列的GPC標準譜圖，對應(yīng)不同相對分子質(zhì)量樣品的保留時間，以lgM對t作圖，所得曲線即為“校正曲線"。通過校正曲線，就能從GPC譜圖上計算各種所需相對分子質(zhì)量與相對分子質(zhì)量分布的信息。聚合物中能夠制得標準樣的聚合物種類并不多，沒有標準樣的聚合物就不可能有校正曲線，使用GPC方法也不可能得到聚合物的相對分子質(zhì)量和相對分子質(zhì)量分布。對于這種可以使用普適校正原理。

普適校正原理

由于GPC對聚合物的分離是基于分子流體力學(xué)體積，即對于相同的分子流體力學(xué)體積，在同一個保留時間流出，即流體力學(xué)體積相同。

兩邊取對數(shù)：即如果已知標準樣和被測高聚物的k、α值，就可以由已知相對分子質(zhì)量的標準樣品M1標定待測樣品的相對分子質(zhì)量M2。

凝膠種類

聚丙烯酰胺凝膠

凝膠色譜法：是一種人工合成凝膠，是以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)成的，經(jīng)干燥粉碎或加工成形制成粒狀，控制交聯(lián)劑的用量可制成各種型號的凝膠。交聯(lián)劑越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠－P（Bio-Gel P），由日本Tosoh的TSKGEL的pw系列，適合蛋白和多糖的純化。

Tosoh的TSKGEL的pw系列

交聯(lián)葡聚糖凝膠：⑴Sephadex G交聯(lián)葡聚糖的商品名為Sephadex，不同規(guī)格型號的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯?dāng)?shù)為凝膠得水值的10倍。例如，G-25為每克凝膠膨脹時吸水2.5克，同樣G-200克每克干膠吸水20克。交聯(lián)葡聚糖凝膠的種類有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G"反映，凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分部范圍。⑵Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物，能溶于水及親脂溶劑，用于分離不溶于水的物質(zhì)。

瓊脂糖凝膠：商品名很多，常見的有，Sepharose（瑞典，pharmacia），Bio-Gel-A（美國Bio-Rad）等。瓊脂糖凝膠是依靠糖鏈之間的次級鏈如氫鍵來維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的疏密依靠瓊脂糖的濃度。一般情況下，它的結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的，可以在許多條件下使用（如水，pH4-9范圍內(nèi)的鹽溶液）。瓊脂糖凝膠在40℃以上開始融化，也不能高壓消毒，可用化學(xué)滅菌活處理。

實驗技術(shù)

層析柱

層析柱是凝膠層析技術(shù)中的主體，一般用玻璃管或有機玻璃管。層析柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量大，可加大柱的直徑，一般制備用凝膠柱，直徑大于2厘米，但在加樣時應(yīng)將樣品均勻分布于凝膠柱床面上。此外，直徑加大，洗脫液體體積增大，樣品稀釋度大。分離度取決于柱高，為分離不同組分，凝膠柱床必須有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關(guān)，但由于軟凝膠柱過高擠壓變形阻塞，一般不超過1米。分族分離時用短柱，一般凝膠柱長20-30厘米，柱高與直徑的比較5:1─10:1，凝膠床體積為樣品溶液體積的4-10倍。分級分離時柱高與直徑之線為20:1─100:1，常用凝膠柱有50×25厘米，10×25厘米。層析柱濾板下的死體積應(yīng)盡可能的小，如果支掌濾板下的死體積大，被分離組分之間重新混合的可能性就大，其結(jié)果是影響洗脫峰形，出現(xiàn)拖尾出象，降低分辨力。在精確分離時，死體積不能超過總床體積的1/1000。

根據(jù)所需凝膠體積，估計所需干膠的量。一般葡聚糖凝膠吸水后的凝膠體積約為其吸水量的2倍，例如Sephadex G-20的吸水量為20，1克Sephadex G─200吸水后形成的凝膠體積約40ml。凝膠的粒度也可影響層析分離效果。粒度細胞分離效果好，但阻力大，流速慢。一般實驗室分離蛋白質(zhì)采用100-200號篩目的的Sephadex G-200效果好，脫鹽用Sephadex G-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。

凝膠的制備

商品凝膠是干燥的顆粒使用前需直接在欲使用的洗脫液中膨脹。為了加速膨脹，可用加熱法，即在沸水浴中將濕凝膠逐漸升溫至近沸，這樣可大大中速膨脹，通常在1-2小時內(nèi)即可完成。特別是在使用軟膠時，自然膨脹需24小時至數(shù)天，而用加熱法在幾小時內(nèi)就可完成。這種方法不但節(jié)約時間，而且還可消毒，除去凝膠中污染的細菌和排除膠內(nèi)的空氣。

樣品溶液處理

樣品溶液如有沉淀應(yīng)過濾或離心除去，如含脂類可高速離心或通過Sephadex G-15短柱除去。樣品的粘度不可大，含蛋白為超過4%，粘度高影響分離效果。上柱樣品液的體積根據(jù)凝膠床體積的分離要求確定。分離蛋白質(zhì)樣品的體積為凝膠床的1-4%（一般約0.5-2ml），進行分族分離時樣品液可為凝膠床的10%，在蛋白質(zhì)溶液除鹽時，樣品可達凝膠床的20-30%。分級分離樣品體積要小，使樣品層盡可能窄，洗脫出的峰形較好。

防止微生物污染

交聯(lián)葡聚糖和瓊脂糖都是多糖類物質(zhì)，防止微生物的生長，在凝膠層析中十分重要，常用的抑菌劑有:

⑴疊氨鈉（NaN3）

在凝膠層析中只要用0.02%疊氮鈉已足夠防止微生物的生長，疊氮鈉易溶一水，在20℃時約為40%；它不與蛋白質(zhì)或碳水化合物相互作用，因此疊氮鈉不影響抗體活力；不會改變蛋白質(zhì)和碳水化合物的層析我特性。疊氮鈉可干擾熒光標記蛋白質(zhì)。

⑵可樂酮[Cl3C-C(OH)(CH3)2]

在凝膠層析中使用濃度為0.01-0.02%。在微酸性溶液中它的殺菌效果最jia，在強堿性溶液中或溫度高于60℃時易引起分解而失效。

⑶乙基汞代巰基水楊suan鈉

在凝膠層析中作為抑菌劑使用濃度為0.05-0.01%。在微酸性溶液中最為有效。重金屬離子可使乙基代巰基的物質(zhì)結(jié)合，因而包含疏基的蛋白質(zhì)可在不同程度上降低它的抑菌效果。

⑷苯基汞代鹽

在凝膠層析中使用濃度為0.001-0.01%。在微堿性溶液中抑效果最jia，長時間放置時可與鹵素、硝酸根離子作用而產(chǎn)生沉淀；還原劑可引起此化合物分解；含疏基的物質(zhì)亦可降低或抑制它的抑菌作用。

實驗部分

直接法：在測定淋出液濃度的同時測定其粘度或光散射，從而求出其分子量。

間接法：用一組分子量不等的、單分散的試樣為標準樣品，分別測定它們的淋出體積和分子量，則可確定二者之間的關(guān)系。


應(yīng)用

凝膠色譜不但可以用于分離測定高聚物的相對分子質(zhì)量和相對分子質(zhì)量分布，同時根據(jù)所用凝膠填料不同，可分離脂溶性和水溶性物質(zhì)，分離相對分子質(zhì)量的范圍從幾百萬到100以下。近年來，凝膠色譜也廣泛用于小分子化合物。相對分子質(zhì)量相近而化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)，不可能通過凝膠滲透色譜法達到wan全分離純化的目的。凝膠色譜不能分辨分子大小相近的化合物，相對分子質(zhì)量相差需在10%以上才能得到分離。

研究動向

凝膠色譜的大量研究工作仍是多方面的，其中儀器、填料、聯(lián)用技術(shù)、色譜理論等方面的進展是和整個液體色譜的進展相關(guān)的。但是下面四個研究動向意義較大，值得注意。通過與其他儀器聯(lián)用，解決凝膠色譜法測定高聚物分子量分布從相對法向絕對法過渡。測定高聚物分子量分布是凝膠色譜最重要的應(yīng)用。試樣先根據(jù)分子體積(即分子量)分離后再檢測各組分的分子量及含量。在凝膠色譜中試樣的分離是在色譜柱中進行的，被分離后的組分在流出柱子時就同時連續(xù)地用濃度檢測器和分子量檢測器分別檢測各組分的濃度和分子量，把兩個檢測器的輸出訊號用記錄儀記錄后即得反映分子量分布的凝膠色譜曲線。過去由于沒有比較靈敏和瞬時響應(yīng)的分子量檢測器，因而利用一組不同分子量的標樣來標定色譜柱，然后從分子量淋出體積的標定曲線來作數(shù)據(jù)換算。這種用相對方法來檢測分子量雖然暫時解決了問題，但是隨之而來的是實驗工作量增加以及數(shù)據(jù)處理方法上存在困難。實驗數(shù)據(jù)的可靠性在很大程度上決定于標定曲線、標樣分子量數(shù)值以及數(shù)據(jù)處理方法的可靠性。其中色譜柱分離效率不理想所引起的色譜峰加寬效應(yīng)的改正，不但實驗方法比較煩瑣，而且數(shù)據(jù)處理也比較復(fù)雜，需要用電子計算機來計算。所以雖然文獻中已經(jīng)推薦許多據(jù)說是比較滿意的計算方法，但這總不是一個根本解決的方法。只有真正找到絕對分子量檢測器，問題才算較好解決。原有的許多分子量測定方法，由于不能做到足夠靈敏的瞬時響應(yīng)而未能成功地在凝膠色譜上應(yīng)用。最近Ouano用激光小角光散射儀(LALLS)來作分子量檢測器得到比較好的結(jié)果。實驗數(shù)據(jù)不需要標定曲線，也不必進行峰加寬改正。

由于激光的準直性較好，強度較大，可以允許在較小的角度下測量較稀溶液的散射光強，由此可以直接計算出重均分子量的近似值而不需要象經(jīng)典光散射那樣實驗數(shù)據(jù)還要對濃度和散射角度向零作雙外推。實驗上，凝膠色譜儀和激光小角光散射儀聯(lián)用后，還可與計算機直接聯(lián)接進行數(shù)據(jù)處理。在一次實驗進行完畢后，所需要的數(shù)據(jù)可全部立即取得。GPC-LALLS似乎得到更合理的數(shù)值。激光小角散射儀已開始商品化，預(yù)計不久將會有更多的研究工作，來說明已經(jīng)在何種程度上解決了凝膠色譜的相對測定過渡到絕對測定。

凝膠色譜中的濃度檢測器和通常的液體色譜一樣仍然是一個薄弱環(huán)節(jié)，繼續(xù)在尋找更理想的檢測器。最chang用的仍然是示差折光檢測器和紫外檢測器。