一、微量凱氏(kjeldahl)定氮法
 

　　樣品與濃硫酸共熱。含氮有機物即分解產(chǎn)生氨(消化)，氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經(jīng)強堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和的程度可計算得樣品之氮含量。若以甘氨酸為例，其反應(yīng)式如下：
 

　　NH2 CH2 COOH+3H2 SO4 ――2CO2 +3SO2 +4H2O+NH3 (1)
 

　　2NH3 +H2 SO4 ――(NH4 )2 SO4 (2)
 

　　(NH4 )2 SO4 +2NaOH――2H2 O+Na2 SO4 +2NH3 (3)
 

　　反應(yīng)(1)、(2)在凱氏瓶內(nèi)完成，反應(yīng)(3)在凱氏蒸餾裝置中進行。
 

　　為了加速消化，可以加入CuSO4作催化劑，K2SO4以提高溶液的沸點。收集氨可用硼酸溶液，滴定則用強酸。實驗和計算方法這里從略。
 

　　計算所得結(jié)果為樣品總氮量，如欲求得樣品中蛋白含量，應(yīng)將總氮量減去非蛋白氮即得。如欲進一步求得樣品中蛋白質(zhì)的含量，即用樣品中蛋白氮乘以6.25即得。
 

　　二、雙縮脲法(biuret法)
 

　　(一)實驗原理
 

　　雙縮脲(NH3CONHCONH3)是兩個分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物。在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。
 

　　紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。測定范圍為1-10mg蛋白質(zhì)。干擾這一測定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、tris緩沖液和某些氨基酸等。
 

　　此法的優(yōu)點是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。
 

　　(二)試劑與器材
 

　　1.試劑：
 

　　(1)標準蛋白質(zhì)溶液：用標準的結(jié)晶牛血清清蛋白(bsa)或標準酪蛋白，配制成10mg/ml的標準蛋白溶液，可用bsa濃度1mg/ml的a280為0.66來校正其純度。如有需要，標準蛋白質(zhì)還可預(yù)先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計算出其純度，再根據(jù)其純度，稱量配制成標準蛋白質(zhì)溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05NaOH配制。
 

　　(2)雙縮脲試劑：稱以1.50克硫酸銅(CuSO4•5H2O)和6.0克酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6•4H2O)，用500毫升水溶解，在攪拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀釋到1升，貯存于塑料瓶中(或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中)。此試劑可長期保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，則需要重新配制。
 

　　2.器材：
 

　　可見光分光光度計、大試管15支、旋渦混合器等。
 

　　(三)操作方法
 

　　1.標準曲線的測定：取12支試管分兩組，分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的標準蛋白質(zhì)溶液，用水補足到1毫升，然后加入4毫升雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫(20～25℃)下放置30分鐘，于540nm處進行比色測定。用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照液。取兩組測定的平均值，以蛋白質(zhì)的含量為橫座標，光吸收值為縱座標繪制標準曲線。
 

　　2、樣品的測定：取2～3個試管，用上述同樣的方法，測定未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。注意樣品濃度不要超過10mg/ml。
 

　　三、folin―酚試劑法(lowry法)
 

　　(一)實驗原理
 

　　這種蛋白質(zhì)測定法是最靈min的方法之一。過去此法是應(yīng)用*泛的一種方法，由于其試劑乙的配制較為困難(現(xiàn)在已可以訂購)，近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即folin―酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。
 

　　這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。folin―酚試劑中的磷鉬酸鹽―磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色(鉬蘭和鎢蘭的混合物)。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。
 

　　folin―酚試劑法最早由lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測定的基本步驟。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。這個測定法的優(yōu)點是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點是費時間較長，要精確控制操作時間，標準曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。
 

　　對雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾lowry反應(yīng)。而且對后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素(0.5%)，硫酸納(1%)，硝酸納(1%)，三lv乙酸(0.5%)，乙醇(5%)，乙mi(5%)，丙酮(0.5%)等溶液對顯色無影響，但這些物質(zhì)濃度高時，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉―*溶液，即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色后會色淺，則必須提高碳酸鈉―*溶液的濃度1～2倍。
 

　　進行測定時，加folin―酚試劑時要特別小心，因為該試劑僅在酸性ph條件下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只在ph=10的情況下發(fā)生，故當folin一酚試劑加到堿性的銅―蛋白質(zhì)溶液中時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸―磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。
 

　　此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。
 

　　此法可檢測的蕞低蛋白質(zhì)量達5mg。通常測定范圍是20~250mg。
 

　　(二)試劑與器材
 

　　1.試劑
 

　　(1)試劑甲：
 

　　(a)10克Na2CO3，2克NaOH和0.25克酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6•4H2O)。溶解于500毫升蒸餾水中。
 

　　(b)0.5克硫酸銅(CuSO4•5H2O)溶解于100毫升蒸餾水中，每次使用前，將50份(a)與1份(b)混合，即為試劑甲。
 

　　(2)試劑乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克鎢酸鈉(Na2WO4•2H2O),25克鉬酸鈉(Na2MOO4•2H2O)及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小時，回流結(jié)束時，加入150克硫酸鋰(Li2SO4)，50毫升蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過量的溴。冷卻后溶液呈黃色(如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟)。稀釋至1升，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時用標準NaOH滴定，酚酞作指示劑，然后適當稀釋，約加水1倍，使最終的酸濃度為1n左右。
 

　　(3)標準蛋白質(zhì)溶液: 精確稱取結(jié)晶牛血清清蛋白或g―球蛋白，溶于蒸餾水，濃度為250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁，可改用0.9%NaCl溶液。
 

　　2.器材
 

　　(1)可見光分光光度計
 

　　(2)旋渦混合器
 

　　(3)秒表
 

　　(4)試管16支
 

　　(三)操作方法
 

　　1.標準曲線的測定：取16支大試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分成兩組，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升標準蛋白質(zhì)溶液(濃度為250mg/ml)。用水補足到1.0毫升，然后每支試管加入5毫升試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫(20～25℃)放置10分鐘。再逐管加入0.5毫升試劑乙(folin―酚試劑)，同樣立即混勻。這一步混合速度要快，否則會使顯色程度減弱。然后在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照，于700nm處測定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質(zhì)的量為橫座標，吸光度值為縱座標，繪制出標準曲線。
 

　　注意：因lowry反應(yīng)的顯色隨時間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時間，即第1支試管加入5毫升試劑甲后，開始計時，1分鐘后，第2支試管加入5毫升試劑甲，2分鐘后加第3支試管，余此類推。全部試管加完試劑甲后若已超過10分鐘，則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙，1分鐘后第2支試管加入0.5毫升試劑乙，2分鐘后加第3支試管，余此類推。待最后一支試管加完試劑后，再放置30分鐘，然后開始測定光吸收。每分鐘測一個樣品。
 

　　進行多試管操作時，為了防止出錯，每位學(xué)生都必須在實驗記錄本上預(yù)先畫好下面的表格。表中是每個試管要加入的量(毫升)，并按由左至右，由上至下的順序，逐管加入。最下面兩排是計算出的每管中蛋白質(zhì)的量(微克)和測得的吸光度值。
 

　　2.樣品的測定：取1毫升樣品溶液(其中約含蛋白質(zhì)20~250微克)，按上述方法進行操作，取1毫升蒸餾水代替樣品作為空白對照。通常樣品的測定也可與標準曲線的測定放在一起，同時進行。即在標準曲線測定的各試管后面，再增加3個試管。如上表中的8、9、10試管。
 

　　根據(jù)所測樣品的吸光度值，在標準曲線上查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)量，從而計算出樣品溶液的蛋白質(zhì)濃度。
 

　　注意:由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測定法通常只適用于測定蛋白質(zhì)的相對濃度(相對于標準蛋白質(zhì))。
 

　　四、改良的簡易folin―酚試劑法
 

　　(一)試劑
 

　　1.試劑甲：堿性銅試劑溶液中，含0.5n NaOH、10%Na2CO3、0.1%酒石酸鉀和0.05%硫酸銅，配制時注意硫酸銅用少量蒸餾水溶解后，最后加入。
 

　　2.試劑乙：與前面的基本法相同。臨用時加蒸餾水稀釋8倍。
 

　　3.標準蛋白質(zhì)溶液：同基本法。
 

　　(二)操作步驟
 

　　測定標準曲線與樣品溶液的操作方法與基本法相同。只是試劑甲改為1毫升，室溫放置10分鐘后，試劑乙改為4毫升。在55℃恒溫水浴中保溫5分鐘。用流動水冷卻后，在660nm下測定其吸光度值。
 

　　改良的快速簡易法，可獲得與folin―酚試劑法(即lowry基本法)相接近的結(jié)果。
 

　　五、考馬斯亮蘭法(bradford法)
 

　　(一)實驗原理
 

　　雙縮脲法(biuret法)和folin—酚試劑法(lowry法)的明顯缺點和許多限制，促使科學(xué)家們?nèi)ふ腋玫牡鞍踪|(zhì)溶液測定的方法。
 

　　1976年由bradford建立的考馬斯亮蘭法(bradford法)，是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計的。這種蛋白質(zhì)測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法。
 

　　考馬斯亮蘭g-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置(lmax)，由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。
 

　　在595nm下測定的吸光度值a595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。
 

　　(二)試劑與器材
 

　　1.試劑：
 

　　(1)標準蛋白質(zhì)溶液，用g—球蛋白或牛血清清蛋白(bsa)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的標準蛋白質(zhì)溶液。
 

　　(2)考馬斯亮蘭g—250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭g—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀釋至1升。
 

　　2.器材：
 

　　(1)可見光分光光度計
 

　　(2)旋渦混合器
 

　　(3)試管16支
 

　　(三)操作方法
 

　　1.標準方法
 

　　(1)取16支試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分為兩組按表中順序，分別加入樣品、水和試劑，即用1.0mg/ml的標準蛋白質(zhì)溶液給各試管分別加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用無離子水補充到0.1ml。最后各試管中分別加入5.0ml考馬斯亮蘭g—250試劑，每加完一管，立即在旋渦混合器上混合(注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除)。未知樣品的加樣量見下表中的第8、9、10管。
 

　　(2)加完試劑2-5分鐘后，即可開始用比色皿，在分光光度計上測定各樣品在595nm處的光吸收值a595，空白對照為第1號試管，即0.1mlH2O加5.0mlg—250試劑。
 

　　注意：不可使用石英比色皿(因不易洗去染色)，可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長時間浸泡。
 

　　2.微量法
 

　　當樣品中蛋白質(zhì)濃度較稀時(10-100mg/ml),可將取樣量(包括補加的水)加大到0.5ml或1.0ml,空白對照則分別為0.5ml或1.0ml H2O,考馬斯亮藍g-250試劑仍加5.0ml,同時作相應(yīng)的標準曲線，測定595nm的光吸收值。
 

　　0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的a595約為0.29。
 

　　六、紫外吸收法
 

　　蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度(即光密度值)與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進行蛋白質(zhì)含量的測定。
 

　　紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后仍能回收使用。低濃度的鹽，例如生化制備中常用的(NH4)2SO4等和大多數(shù)緩沖液不干擾測定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測，因為此時只需測定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其絕對值。
 

　　此法的特點是測定蛋白質(zhì)含量的準確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標準曲線法測定蛋白質(zhì)含量時，對那些與標準蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測定與標準蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大的干擾。核酸的干擾可以通過查校正表，再進行計算的方法，加以適當?shù)男Ｕ?。但是因為不同的蛋白質(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過校正，測定的結(jié)果還是存在一定的誤差。
 

　　此外，進行紫外吸收法測定時，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因ph的改變而有變化，因此要注意溶液的ph值，測定樣品時的ph要與測定標準曲線的ph相一致。