ELISA法檢測中應(yīng)注意的哪些問題？
ELISA法特異性強 ,敏感性高 ,操作快速簡便 ,因而是免疫學(xué)檢驗中zui為常用的方法 ,也是我們基層醫(yī)院檢驗科免疫學(xué)檢驗的主要技術(shù)手段。我科乙肝五項、丙肝抗體、HIV抗體、梅毒抗體等均用ELISA法檢測。其中HBsAg的檢測量zui大。我們在實際工作中體會到ELISA法檢測的全程質(zhì)量控制很重要 ,的試劑、良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件。現(xiàn)將我們平時在操作中認(rèn)為需要重視的步驟及遇到的一些問題報告如下 :
1 標(biāo)本的采集和保存
一般在醫(yī)學(xué)免疫檢驗中均以血清作為檢測標(biāo)本。血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集 ,應(yīng)注意避免溶血 ,因紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì) ,以HRP為標(biāo)記的 ELISA測定中 ,溶血標(biāo)本可能會增加非特異性顯色。血清標(biāo)本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染 ,菌體中可能含有內(nèi)源性HRP,也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。標(biāo)本儲存時間過長,IgG可聚合成多聚體 ,在間接ELISA測定中導(dǎo)致本底過深 ,甚至造成假陽性。一般說來,在5天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于4℃,超過1周測定的需低溫冰存。
2 試劑的準(zhǔn)備
按試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水 ,包括用于洗滌的 ,應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。從冰箱中取出的試驗用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應(yīng)及時放回冰箱保存。
3 加樣
在ELISA中一般有3次加樣步聚,即加標(biāo)本,加酶結(jié)合物,加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在ELEISA板孔的底部,避免加在孔壁上部 ,并注意不可濺出 ,不可產(chǎn)生氣泡。加標(biāo)本一般用微量加樣器 ,按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴,以免發(fā)生交叉污染。需用稀釋的血清,可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液,再在其中加入血清標(biāo)本 ,然后在微型震蕩器上震蕩1min以保證混和。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時可用定量多道加液器 ,使加液過程迅速完成。
4 保溫
在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng) ,即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后?？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間。ELISA屬固相免疫測定,抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例加入板孔中的標(biāo)本,其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機會 ,只有zui貼近孔壁的一層溶液中抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程,因此需經(jīng)擴散才能達到反應(yīng)的終點。在其后加入的酶標(biāo)·記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時間的溫育ELISA法一般均采用37℃水浴,可將ELISA板底置于水浴箱中,使溫度迅速平衡。為避免蒸發(fā),一定要用封板條封住反應(yīng)孔。若用保溫箱, ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi),在盒底墊濕的紗布,zui后將ELISA板放在濕紗布上。無論是水浴還是濕盒溫育 ,反應(yīng)板均不宜疊放 ,以保證各板的溫度都能迅速平衡。應(yīng)注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。
5 洗滌
洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟,但卻也決定著實驗的成敗。ELISIA就是靠洗滌來達到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),以在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的,而在洗滌時又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。可以說在ELISA操作中,洗滌是zui主要的關(guān)鍵技術(shù),應(yīng)引起操作者的高度重視?，F(xiàn)將我們在洗板中遇到的幾個問題歸納如下:
5. 1血液凝固不全引起的假陽性血液凝固不全時有纖維吸附現(xiàn)象,致使洗板不凈,殘留的非固相酶產(chǎn)生的非特異性顯色影響結(jié)果,而且這種顯色很深易誤認(rèn)為強陽性。據(jù)統(tǒng)計,我們對12例這種現(xiàn)象的陽性結(jié)果進行重新分離血清再測定,結(jié)果其中有10例為陰性,2例為真陽性,且乙肝五項1例為大三陽1例為小三陽。所以在洗板完畢，拍板時要注意觀察孔內(nèi)是否有纖維蛋白原吸附現(xiàn)象,因此而出現(xiàn)的陽性應(yīng)重新復(fù)查。
5. 2 洗液要臨用前新鮮配制,放置時間過長易產(chǎn)生絮狀物或混濁,造成賭孔或花板。
5. 3 洗板時間我科使用上海榮盛公司提供的 EL ISA檢測HBsAg的試劑 ,說明書介紹洗滌5次,間隔5 s～15s進行洗板。經(jīng)過長期實驗摸索,我們改為洗滌6次,間隔30s,這樣可避免洗滌不凈而引起的假陽性。我們曾做過對比試驗:84份血清標(biāo)本以上述兩種洗板方法分別測定HBsAg,結(jié)果5次15s有2例陽性 , 3例弱陽性,而6次30s洗板有1例陽性其為陰性。后經(jīng)五項指標(biāo)檢查只有同時陽性的1例為大三陽;2例抗 2HBs陽性其余指標(biāo)陰性,故不支持 HBsAg陽性結(jié)果,是由于洗板不凈而引起的假陽性。
6 比色與結(jié)果判定應(yīng)注意的問題
顯色后一定要在規(guī)定時間內(nèi)進行比色。判讀結(jié)果不能僅用目測 ,一定要用酶標(biāo)儀測定 ,上酶標(biāo)儀要注意板條各孔中比色液體積的一致,否則會產(chǎn)生誤差。我們曾做過對比試驗:取清潔板條24孔每孔加蒸餾水100ul,用博賽2010型酶標(biāo)儀,波長450測定其吸光度,均值A(chǔ) =0. 015,取出板條每孔補加蒸餾水50 ul及蒸餾水150 ul,同條件下測定其吸光度,均值A(chǔ)= 0.009,結(jié)果孔內(nèi)100 ul體積的吸光度顯著高于 150ul體積,原因是比色液體積較少即液面較低與孔內(nèi)壁的折光較強而使吸光度增高。故測定中應(yīng)注意滴加顯色劑及終止液的量。
